2022年新版食品安全抽检实施细则颁布了针对于鱼、虾、蟹、鳖及海参等水产品可食组织中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定方法——《GB 31656.11-2021 水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定》。
本标准替代了《GB/T 22961-2008 河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法》其中第二法——液相色谱-串联质谱法为今年新增的检测方法。逗点生物参照该标准进行试验，并优化了部分参数，建立了一份具有良好回收率及稳定性，能满足国标要求的SPE-HPLC-MS/MS方法，可供参考。
一、样品提取
准确称取粉碎均匀的鱼、虾等水产类样品2 g（精确至0.02 g）于干净离心管中，加入6 mL Na2EDTA-Mcllvaine溶液（pH=4±0.05）和2 mL醋酸铅溶液，涡旋混合1 min，超声10 min，4℃下以8000离心r/min离心5 min，取上清液于另一干净离心管，残渣继续加入6 mL Mcllvaine-Na2EDTA溶液（pH=4±0.05）按上述方式重复提取两次，合并全部提取液，加入10 mL正己烷，涡旋1 min，8000 r/min离心5 min，弃正己烷层，下层液取出10 mL待净化。
Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（0.1mol/L）：称取柠檬酸12.9g、磷酸氢二钠10.9g、乙二胺四乙酸二钠37.2g,各自加水适量使溶解，混合，用水稀释至1000mL,用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节pH至4.0±0.05。
醋酸铅溶液（20.0g/L）：取醋酸铅20.0g,加水溶解并稀释至1000mL。
二、样品净化（Copure® HLB，60mg/3mL）
活化：5 mL甲醇，5 mL水
上样：上述待净化液
淋洗：5 mL水，5 mL 5%甲醇-水溶液
洗脱：5 mL甲醇
收集全部洗脱液，45℃下氮吹至100 μL，加入0.1%甲酸溶液定容至1 mL,过尼龙滤膜，上机。
三、基质标准曲线溶液的制备
取空白基质同正常样品一样操作，收集洗脱液后，于洗脱液中分别加入适量标液，再与其他样品洗脱液一同氮吹，定容，是终上机溶液的浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L。
四、仪器条件
1）色谱条件
仪器：UPLC-MS/MS（Thermo Fisher TSQ Endura）
色谱柱：Hypersil GOLD C18 (2.1 mm×100 mm，1.9 μm)
流动相：A：水（0.1 %甲酸） B：甲醇（0.1 %甲酸）
洗脱方式：梯度洗脱，见表1
流速：0.3 mL/min
柱温：30℃
进样量：5 μL
2）质谱条件
离子源：HESI
电喷雾电压：3500 V
鞘气压力：40 arb
辅气压力：2 arb
离子传输管：380 ℃
辅气温度：350 ℃
表2 组分名称、保留时间及特征离子一览表（*为定量离子）
表3 兽残加标回收实验结果
图1 添加水平为100.0 μg/kg时大头鱼中四环素类的总离子流图
图2 添加水平为100.0 μg/kg时虾仁中四环素的总离子流图
六、订购信息
一、样品提取
准确称取粉碎均匀的鱼、虾等水产类样品2 g（精确至0.02 g）于干净离心管中，加入6 mL Na2EDTA-Mcllvaine溶液（pH=4±0.05）和2 mL醋酸铅溶液，涡旋混合1 min，超声10 min，4℃下以8000离心r/min离心5 min，取上清液于另一干净离心管，残渣继续加入6 mL Mcllvaine-Na2EDTA溶液（pH=4±0.05）按上述方式重复提取两次，合并全部提取液，加入10 mL正己烷，涡旋1 min，8000 r/min离心5 min，弃正己烷层，下层液取出10 mL待净化。Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（0.1mol/L）：称取柠檬酸12.9g、磷酸氢二钠10.9g、乙二胺四乙酸二钠37.2g,各自加水适量使溶解，混合，用水稀释至1000mL,用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节pH至4.0±0.05。
醋酸铅溶液（20.0g/L）：取醋酸铅20.0g,加水溶解并稀释至1000mL。
二、样品净化（Copure® HLB，60mg/3mL）
活化：5 mL甲醇，5 mL水
上样：上述待净化液
淋洗：5 mL水，5 mL 5%甲醇-水溶液
洗脱：5 mL甲醇
收集全部洗脱液，45℃下氮吹至100 μL，加入0.1%甲酸溶液定容至1 mL,过尼龙滤膜，上机。
三、基质标准曲线溶液的制备
取空白基质同正常样品一样操作，收集洗脱液后，于洗脱液中分别加入适量标液，再与其他样品洗脱液一同氮吹，定容，是终上机溶液的浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L。
四、仪器条件
1）色谱条件
仪器：UPLC-MS/MS（Thermo Fisher TSQ Endura）
色谱柱：Hypersil GOLD C18 (2.1 mm×100 mm，1.9 μm)
流动相：A：水（0.1 %甲酸） B：甲醇（0.1 %甲酸）
洗脱方式：梯度洗脱，见表1
流速：0.3 mL/min
柱温：30℃
进样量：5 μL
2）质谱条件
离子源：HESI
电喷雾电压：3500 V
鞘气压力：40 arb
辅气压力：2 arb
离子传输管：380 ℃
辅气温度：350 ℃
表2 组分名称、保留时间及特征离子一览表（*为定量离子）
表3 兽残加标回收实验结果
图1 添加水平为100.0 μg/kg时大头鱼中四环素类的总离子流图
图2 添加水平为100.0 μg/kg时虾仁中四环素的总离子流图
六、订购信息