孔雀石绿和结晶紫是人工合成的三苯甲烷类化合物，都属于工业染料，因其价格低廉且具有杀菌和驱虫的效果，曾广泛应用于水产养殖中，但孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的生物毒性较强，在生物体内长期累积会对人体造成危害。
逗点生物结合自身产品优势，建立了固相萃取-高效液相色谱-质谱联用法测定虾肉中的孔雀石绿和结晶紫含量的方法，样品在提取后，经中性氧化铝柱固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱-串联质谱仪测定。经验证，加标回收率范围90-110%，RSD值小于5%，满足要求。
二、仪器条件
2.1 色谱条件
仪器：UPLC-MS/MS（Thermo Fisher TSQ Endura）
色谱柱：Commasil® Coreshell C18 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)
流动相：A-水（0.1%甲酸） B-乙腈（0.1%甲酸）
洗脱方式：梯度洗脱，见表1
流速：0.3 mL/ min
柱温：30 ℃
进样量：10 μL
表1 流动相梯度洗脱条件
2.2 质谱条件
离子源：HESI 电喷雾电压：3500 V
鞘气压力：15 arb 辅气压力：1 arb
离子传输管：360 ℃ 辅气温度：380 ℃
表2 孔雀石绿和结晶紫离子对参数（*为定量离子）
三、试验步骤
3.1样本提取
称取5.00 g已捣碎的虾肉于50 mL离心管中，加入400 μL混合内标溶液（孔雀石绿-d5和隐性孔雀石绿-d6）。加入11 mL乙腈，超声波震荡提取2.0 min，2500 rpm涡旋震荡提取5.0 min，8000 r/min离心5.0 min，上清液转移至另一空50 mL离心管。重复提取一次，合并上清液，用乙腈定容至25 mL，摇匀待净化。
3.2样本净化
取Copure® 中性氧化铝柱（货号：COALN31000），加入5.0 mL乙腈活化。加入上述样品待净化液5.00 mL后再加入4.0 mL乙腈进行洗涤，合并收集全部过滤液，45℃水浴氮吹至近干。加入1.0 mL乙腈，超声震荡5.0 min，加入1.0 mL 5 mmol/L乙酸铵，超声波震荡1.0 min，过0.22 μm滤膜后上机测试。
3.3基质空白试验
称取空白试样，按上述步骤进行实验。
四、实验结果
虾肉基质中结晶紫、隐形结晶紫、孔雀石绿及其内标、隐形孔雀石绿及其内标的定量离子对提取色谱图如下所示。
图1 虾肉加标（8.0 μg/kg）中隐性结晶紫
图2 虾肉加标（8.0 μg/kg）中结晶紫
图3 虾肉加标（8.00 μg/kg）中隐形孔雀石绿
图4 虾肉加标（8.00 μg/kg）中孔雀石绿
图5 虾肉加标（8.00 μg/kg）中孔雀石绿-d5
图6 虾肉加标（8.00 μg/kg）中隐形孔雀石绿-d6
虾肉中孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫加标实验回收率结果详见表3，回收率90-110%之间，偏差值均小于5%，回收率和稳定性满足测试要求。
表3 虾肉中孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫加标回收率结果
五、订购信息
